Độ phân giải lipid trong tế bào sống: Một bước đột phá mới trong kính hiển vi quang học hồng ngoại trung siêu siêu phổ

Lipid không chỉ là thành phần cấu trúc của màng tế bào và các phân tử dự trữ năng lượng mà còn có liên quan mật thiết đến sự xuất hiện và phát triển của các bệnh ung thư, béo phì, tiểu đường, bệnh tim mạch, bệnh thoái hóa thần kinh. Tuy nhiên, việc quan sát trực tiếp và phân biệt các loại lipid khác nhau trong tế bào sống từ lâu đã phải đối mặt với những thách thức kỹ thuật. Các phương pháp ghi nhãn huỳnh quang truyền thống bị hạn chế bởi hiệu quả ghi nhãn, tính đặc hiệu và khả năng can thiệp vào các chức năng của tế bào, trong khi các kỹ thuật quang học không nhãn thường gặp khó khăn trong việc phân biệt các phân tử lipid có cấu trúc hóa học tương tự.

Nature Methods đã công bố một nghiên cứu giới thiệu một công nghệ có tên là "Kính hiển vi quang học vùng vân tay siêu phổ" (hyFOPM). Bằng cách sử dụng các chế độ rung liên kết đơn trong vùng vân tay hồng ngoại giữa, công nghệ này cho phép phát hiện không nhãn và chụp ảnh động của sphingomyelin (SM) và cholesterol (Chol) trong tế bào sống.

Nguyên tắc kỹ thuật
Hầu hết các phương pháp quang học không nhãn đều dựa vào tín hiệu trong vùng rung kéo dài CH (khoảng 2800–3000 cm⁻¹), nhưng các dải quang phổ trong vùng này rất giống nhau trên các loại lipid khác nhau, khiến khó phân biệt giữa các loại khác nhau. Ngược lại, vùng vân tay hồng ngoại giữa (900–1730 cm⁻¹) chứa nhiều thông tin rung động liên kết đơn hơn phản ánh cấu trúc độc đáo của các phân tử, chẳng hạn như sự hấp thụ đặc trưng của liên kết amide, liên kết este và vòng steroid.

Thiết kế của hệ thống hyFOPM tập trung vào khái niệm này. Nó sử dụng tia laser phân tầng lượng tử có thể điều chỉnh làm nguồn kích thích, bao phủ phạm vi 900–2932 cm⁻¹ với độ phân giải quang phổ là 2 cm⁻¹. Các xung laser kích thích mẫu để tạo ra tín hiệu quang âm, được phát hiện bởi đầu dò siêu âm để tạo ra hình ảnh siêu âm. Hệ thống này có độ phân giải không gian khoảng 4,3 μm, cho phép chụp ảnh ở cấp độ tế bào sống.

Xác nhận các mô hình lipid
Để xác minh tính khả thi của công nghệ, nhóm nghiên cứu lần đầu tiên chuẩn bị mô hình dung dịch lipid hai chiều chứa cholesterol (Chol), phosphatidylcholine không bão hòa (DOPC) và sphingomyelin (SM).

(1) So sánh đặc điểm quang phổ

Phổ vùng vân tay được thu thập bởi hyFOPM rất phù hợp với kết quả ATR-FTIR. Ba loại lipit biểu hiện các đỉnh quang phổ có thể phân biệt được: cholesterol thể hiện đỉnh hấp thụ mạnh đối với sự biến dạng vòng steroid ở 1056 cm⁻¹; DOPC có độ rung kéo dài C=O của nhóm este ở 1731 cm⁻¹; và sphingomyelin tương ứng với dải amide I, dải amide II và độ rung uốn cong CH₂ của axit béo ở các mức tương ứng là 1645 cm⁻¹, 1555 cm⁻¹ và 1464 cm⁻¹.

(2) Khả năng phân loại và hòa trộn quang phổ
Khi chỉ sử dụng 15 số sóng trong vùng vân tay để hòa trộn tuyến tính, nhiễu xuyên âm giữa cholesterol và sphingomyelin gần bằng 0%, trong khi nhiễu xuyên âm đối với DOPC là 23%. Ngược lại, nhiễu xuyên âm tăng đáng kể khi sử dụng 7 số sóng trong vùng kéo dài CH. Ứng dụng sâu hơn của phân tích phân biệt tuyến tính (LDA) cho thấy độ chính xác phân loại trung bình đạt 96% khi sử dụng vùng dấu vân tay hoặc vùng CH và đạt 97% khi sử dụng tất cả các số sóng.

(3)Mô hình túi đơn lớp khổng lồ (GUV)
Nghiên cứu đã chuẩn bị ba loại GUV để mô phỏng màng tế bào: Mô hình 1, hỗn hợp 1:1 của SM và Chol, tạo thành màng có trật tự dày đặc; Mô hình 2, hỗn hợp 2:2:1 của DOPC, SM và Chol, cùng tồn tại ở các pha trật tự chất lỏng và rối loạn chất lỏng; và Model 3, DOPC nguyên chất, tạo thành màng chất lỏng rối loạn. Hình ảnh thu được bởi hyFOPM ở 2852 cm⁻¹ phù hợp về mặt hình thái với hình ảnh thu được bằng phương pháp nhuộm huỳnh quang Nile Red. Đặc điểm quang phổ của các túi khác nhau tương ứng với lipid nguyên chất, xác nhận rằng có thể xác định được các thành phần riêng lẻ trong màng hỗn hợp.

(4) Ứng dụng kiểm soát chất lượng
Bằng cách thực hiện các phép đo quang phổ trên 10 GUV khác nhau cho từng loại và vẽ sơ đồ pha ba pha, nhóm nghiên cứu nhận thấy rằng thành phần lipid thực tế sai lệch so với tỷ lệ mục tiêu (sai lệch khoảng 40%). Điều này chỉ ra rằng hyFOPM có thể được sử dụng để đánh giá chất lượng trong quá trình điều chế GUV.

Ứng dụng trong tế bào sống
Nghiên cứu tiếp tục áp dụng hyFOPM cho các tế bào sống, quan sát những thay đổi năng động của sphingomyelin và cholesterol trong hai mô hình tế bào tương ứng.

(1) Tích lũy Sphingomyelin trong tế bào A549
Các tế bào ung thư biểu mô tuyến phổi ở người (A549) đã được điều trị bằng hợp chất chống ung thư axit 2-hydroxyoleic (2-OHOA), được cho là sẽ gây ra sự tích tụ sphingomyelin. Phổ vùng vân tay (1600–1400 cm⁻¹) được thu thập từ 50 ô, cho thấy diện tích cực đại 1464 cm⁻¹ tăng 117% sau khi xử lý, so với chỉ 23% ở nhóm đối chứng trong cùng thời kỳ. Sau đó, hình ảnh được thực hiện trên 3000 tế bào chỉ sử dụng bốn số sóng (2852 cm⁻¹ đối với tổng lượng lipid, 1540 cm⁻¹ đối với protein amide II, 1464 cm⁻¹ đối với sphingomyelin và 1048 cm⁻¹ đối với cholesterol). Kết quả cho thấy tín hiệu sphingomyelin tiếp tục tăng ở thời điểm 48 và 72 giờ sau điều trị, trong khi tín hiệu cholesterol không có sự thay đổi đáng kể.

(2) Tải cholesterol trong tế bào HEK
Tế bào thận phôi người (HEK293) được ủ cùng với phức hợp methyl-β-cyclodextrin-cholesterol (MβCD-Chol) để tăng cholesterol trong màng tế bào. Phổ vùng vân tay của 50 tế bào cho thấy diện tích đỉnh 1048 cm⁻¹ tăng 161% sau khi điều trị, trong khi đỉnh 1464 cm⁻¹ của sphingomyelin giảm nhẹ—phù hợp với đặc tính đã biết là cyclodextrin chiết xuất một số lipid màng trong khi cung cấp cholesterol. Hình ảnh đa sóng của 3000 tế bào tiếp tục xác nhận độ cao của tín hiệu cholesterol, với tín hiệu lipid tổng tăng nhẹ và tín hiệu protein ít thay đổi.

Ý nghĩa và triển vọng
Nghiên cứu này chứng minh khả năng phân biệt các phân tử lipid có cấu trúc hóa học tương tự trong tế bào sống mà không cần dán nhãn. So với các phương pháp truyền thống dựa vào ghi nhãn huỳnh quang hoặc đồng vị, hyFOPM tránh được các vấn đề như hiệu quả ghi nhãn và can thiệp vào chức năng tế bào, đồng thời tính chọn lọc của nó có thể được điều chỉnh linh hoạt theo đặc điểm quang phổ của lipid mục tiêu bằng cách điều chỉnh số sóng kích thích.

Độ đặc hiệu quang phổ của hệ thống hiện tại ở vùng dấu vân tay cao hơn so với vùng kéo dài CH, điều này mở ra khả năng phân biệt nhiều phân nhóm lipid hơn. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng việc kết hợp các kỹ thuật hòa trộn quang phổ tiên tiến, chẳng hạn như học sâu, dự kiến ​​sẽ cải thiện hơn nữa độ nhạy và độ đặc hiệu. Ngoài ra, kính hiển vi quang âm hồng ngoại giữa có thể đạt độ sâu hình ảnh trên 150 μm trong mô và các ứng dụng trong tương lai có thể được mở rộng sang các mẫu dày hoặc cài đặt in vivo. Tăng tốc công nghệ (ví dụ: lấy mẫu dưới phổ) và thu nhỏ hệ thống là những hướng quan trọng để thúc đẩy công nghệ này hướng tới phân tích tại điểm chăm sóc hoặc thử nghiệm trong phòng thí nghiệm thông thường.